Projekt BlueGenes für das Erlernen molekularbiologischer Methoden

1972 gelang es Paul Berg an der Stanford University of California, San Francisco erstmals, DNA-Fragmente aus dem viralen SV40-Chromosom mit Plasmid-DNA aus E. coli zu einem neu kombinierten DNA-Molekül zu verknüpfen. Er verwendete dabei die aus E. coli stammende Restriktionsendonuklease Eco RI, die sowohl das SV40-Chromosom als auch die Plasmid-DNA jeweils an einer bestimmten Stelle durchtrennt. Die beim Schneiden entstandenen ”sticky ends” der beiden DNA-Moleküle konnten sich aufgrund der Basenkomplementarität zusammenlagern.

Ein weiteres aus Bakterien gewonnenes Enzym, die DNA-Ligase, setzte Berg ein, um die neu kombinierten, nur durch Wasserstoffbrückenbindungen zusammengehaltenen DNA-Moleküle kovalent durch Phosphodiesterbindungen zu verknüpfen. Somit war es zum ersten Mal gelungen, DNA-Moleküle unterschiedlichen Ursprungs in vitro, d.h. im Reaktionsgefäß, zu verknüpfen. Der Transfer und die Expression neu kombinierter DNA-Moleküle in Bakterien gelangen schließlich 1973 (siehe Abbildung 2). Stanley Cohen, Herbert Boyer und Annie Chang (Stanford University of California, San Francisco) benutzten in ihrem Experiment ein Plasmid aus E. coli mit dem Namen pSC101 (SC steht für Stanley Cohen).

Es wies die folgenden Eigenschaften auf:

1. eine Schnittstelle für das Restriktionsenzym Eco RI
2. einen Replikationsursprung (ori), der die Replikation in der Wirtszelle ermöglichte
3. ein Gen für die Tetracyclinresistenz, die Voraussetzung für die Selektion der Plasmid enthaltenden Bakterien.

Das von Cohen, Boyer und Chang durchgeführte gentechnische Experiment hatte zum Ziel, die Antibiotikaresistenz für Kanamycin mit Hilfe des Plasmids pSC101 zu übertragen. Dabei wurde das Plasmid pSC101 wie auch das Kanamycinresistenzgen-tragende Plasmid pSC102 mit dem Enzym Eco RI geschnitten und die entstandenen DNA-Fragmente zusammengebracht. Ein Teil der linearisierten pSC101-Plasmide hybridisierte dabei mit DNA-Fragmenten, die das Kanamycinresistenzgen trugen.

Die nach dem Vorbild Paul Bergs eingesetzte Ligase katalysierte die kovalente Phosphodiesterbindung, sodass ein intaktes neu kombiniertes Plasmid entstand. Danach transferierten Cohen, Boyer und Chang die Plasmide nach einer von ihnen entwickelten Methode in E. coli-Zellen. Zur Selektion der Bakterien, welche die neu kombinierten Plasmide aufgenommen hatten, ließen sie die E. coli-Zellen auf einem Nährboden mit Tetracyclin und Kanamycin wachsen. Das Wachstum von Kolonien mit Tetracyclin/Kanamycin-Doppelresistenz bestätigte den erfolgreichen Transfer des neu kombinierten (rekombinierten) Plasmids sowie die Ausprägung der neuen Eigenschaften in lebenden E. coli-Zellen. Alle molekularbiologischen Werkzeuge, Plasmide, Restriktionsenzyme und Ligasen, die bei diesen Experimenten eingesetzt wurden, sind natürlichen Ursprungs.

Auch heute noch werden in der Gentechnik die gleichen Grundoperationen durchgeführt wie bei diesem ersten gentechnischen Experiment:

1. Schneiden der DNA mit Restriktionsenzymen
2. Einbau der DNA in ein Vehikel (z.B. Plasmide)
3. Einschleusen der rekombinierten DNA-Moleküle in lebende Zellen

Wichtige Werkzeuge zum Einschleusen eines Gens in ein Bakterium sind Plasmide. Diese kleinen, ringförmigen, extrachromosomalen DNA-Moleküle, die natürlicherweise in Bakterien vorkommen, tragen z.B. Resistenzgene, die wichtig für die Selektion der gewünschten Bakterienklone sind. In der Gentechnik werden heutzutage jedoch Plasmide verwendet, denen jene Gene fehlen, die die Information für die Weitergabe der Plasmide von Zelle zu Zelle tragen. Sie wurden gezielt entfernt, um eine unkontrollierte Ausbreitung der Plasmide und damit der auf ihnen festgelegten Informationen (z.B. Antibiotikaresistenzen) zu verhindern. Man spricht deshalb in der Gentechnik von Sicherheitsplasmiden.

Auch das in unseren Experimenten verwendete Plasmid pGEM®-5Zf(+) ist ein solches. Es ist 3.000 bp groß und trägt als sogenannten Selektionsmarker das ß-Lactamase-Gen. Die ß-Lactamase ist ein Enzym, das den ß-Lactam-Ring aller Penicillinderivate, so auch Ampicillin, spaltet und somit die Ampicillinresistenz (Ampr) pGEM®-5Zf(+)-tragender Bakterien bewirkt. Außerdem trägt pGEM®-5Zf(+) einen Replikationsursprung (ori) und kann damit unabhängig vom bakteriellen Chromosom vermehrt werden. In E. coli liegt pGEM®-5Zf(+) in mehreren 100 Kopien vor. Von besonderer Bedeutung für gentechnische Experimente sind die Zahl und Art der Schnittstellen von Restriktionsenzymen auf dem Plasmidring.

Restriktionsenzyme (Restriktionsendonukleasen) spalten DNA an spezifischen Erkennungssequenzen. Dies sind meist Palindrome, d.h. Abschnitte des DNA-Doppelstranges, die jeweils vom 5'- zum 3'-Ende jedes Einzelstranges gelesen, die gleiche Basensequenz haben. Jedes Enzym erkennt eine spezifische Sequenz. Wir verwenden in unseren Experimenten die Restriktionsenzyme Pvu I und Eco R V. Die Namen der Restriktionsenzyme sind Abkürzungen für die Namen der Bakterien, aus denen sie isoliert wurden, z.B. Pvu I aus Proteus vulgaris.

Mittlerweile sind weit über 400 verschiedene Restriktionsenzyme bekannt, die eine Vielzahl von Klonierungsexperimenten ermöglichen. Beim Schneiden des Plasmids pGEM®-5Zf(+) mit Eco R V und Pvu I wird der Doppelstrang des ringförmigen DNA-Moleküls an drei Stellen durchtrennt. Diese zwei Enzyme benutzen wir, um das Plasmid in drei unterschiedlich große DNA-Stücke zu zerschneiden. Die Größe der DNA-Fragmente wird anschließend in der Gel-Elektrophorese analysiert.

Damit Enzyme auch außerhalb der Zelle, z.B. im Reaktionsansatz, ihre Funktion erfüllen können, benötigen sie genau definierte pH- und Ionen-Bedingungen in der sie umgebenden Lösung. Dies wird mit Hilfe von Puffern im Reaktionsansatz erzielt. Da die verwendeten Enzyme meist aus verschiedenen Organismen stammen, müssen auch unterschiedliche Puffer verwendet werden. Bei der Durchführung der Experimente achten Sie deswegen bitte darauf, immer den zu den eingesetzten Enzymen gehörenden Puffer zu verwenden.

Das lacZ-Gen ist ein E. coli-eigenes Gen, welches im Genom des Wildtyps enthalten ist. Um eine erfolgreiche Klonierung dieses Gens nachweisen zu können, wird in unserem Experiment der E. coli-Stamm K12 (JM109) verwendet, dessen lacZ-Gen defekt ist. Man spricht von einer lacZ-Mutante. Bei der Transformation wird das gesamte lacZ-Gen mit Hilfe des Plasmids pGEM®-5Zf(+)/pGEM®-T in E. coli K12 (JM109) übertragen und anschließend kloniert. Somit kann der Stamm E. coli K12 (JM109) wieder eine funktionsfähige ß-Galaktosidase exprimieren. Dieses Enzym spaltet natürlicherweise das Disaccharid Laktose, bestehend aus Galaktose und Glukose, und erschließt es so dem Bakterium als Nahrungsquelle. Es kann jedoch auch das synthetische Substrat 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-ß-D-galaktosid (X-Gal) spalten, was dazu führt, dass ein blauer Indigofarbstoff (siehe Abbildung 5) entsteht. Bakterien, die das lacZ-Gen aufgenommen haben und exprimieren, bilden auf Nährböden, die X-Gal enthalten, blaue Kolonien.

Im Folgenden werden jene genetischen Charakteristika des Bakteriums E. coli K12 (JM109) kurz erläutert, die für die Klonierung des lacZ-Gens von Bedeutung sind.

Chromosomale Änderungen

• D(lac-proAB) Das Chromosom hat den gesamten Bereich lac-proAB verloren; d.h. es trägt keine Gene für den Abbau von Laktose und keine Gene zur Synthese von Prolin.
• endA Die Mutation endA in der DNA spezifischen Endonuklease verhindert, dass fremde DNA angegriffen wird. Damit werden die Klonierungsausbeuten erhöht.

Damit das Plasmid pGEM®-5Zf(+) als Vehikel dienen kann, um ein Gen in das Bakterium einzuschleusen und seine Replikation zu ermöglichen, muss es durch das Schneiden mit einem Restriktionsenzym zunächst linearisiert, d.h. der Ring geöffnet werden. Dazu verwenden wir das Restriktionsenzym Eco RV, das glatte Enden erzeugt. In diesem Fall dient diese Reaktion nur zur Veranschaulichung des prinzipiellen Workflows.

Das Plasmid pGEM®-5Zf(+) wird fertig geschnitten als pGEM®-T Vector geliefert. Das jeweilige 3‘-Ende wurde außerdem mit einer Thyminbase versehen (T-Überhang), um auf einfache Weise PCR-Produkte hineinligieren zu können (Taq Polymerase erzeugt die komplementären A-Überhänge am 3‘-Ende). Hier verwenden wir nicht das im Kit mitgelieferte Kontrollinsert mit A-Überhängen, welches das Gen des Enzyms Luciferase aus Glühwürmchen enthält, sondern eine Sequenz aus dem Vektor-Backbone (9PROPBLUE Blue Genes Control Insert). Beide DNA-Moleküle tragen somit komplementäre Enden, die sich im Reaktionsansatz der Ligation aufgrund der Basenpaarung zusammenlagern (hybridisieren) können. Mit Hilfe des Enzyms T4 DNA-Ligase können schließlich die DNA-Moleküle durch eine Phosphodiester-Bindung zwischen der freien 5'-Phosphatgruppe und der freien 3'-OH-Gruppe der Desoxyribose fest miteinander verknüpft werden.

Die normalerweise für fremde DNA undurchlässige bakterielle Zellwand kann durch eine Behandlung mit einer Calciumchloridlösung durchlässig gemacht werden, und das Bakterium ist dann bedingt zur Aufnahme der Plasmid-DNA fähig. Derart behandelte Zellen nennt man transformationskompetent. Sie können für dieses Experiment gebrauchsfertig bestellt werden. Trotz der chemischen Vorbehandlung der Zellen nimmt nur eines von etwa 10.000 Bakterien die DNA auf (Transformation); die überwiegende Zahl der Bakterien wird daher kein Plasmid tragen.

Bakterien, die das Plasmid pGEM®-T (plus Insert) aufgenommen haben und seine Information exprimieren, sind aufgrund der auf dem Plasmid codierten Ampicillinresistenz gegenüber diesem Antibiotikum unempfindlich. Bringt man nun die Bakterien des Transformationsexperimentes auf eine Agarplatte aus, die Ampicillin enthält, so können lediglich jene Bakterien wachsen, die das Plasmid tragen. Diesen Vorgang bezeichnet man als Selektion.

In einem weiteren Selektionsschritt kann zwischen Bakterien, die ein Plasmid mit durch das Insert unterbrochenem lacZ-Gen und Hintergrund von ungeschnittenem bzw. religiertem pGEM®-T Vector ohne T-Überhänge oder pGEM®-5Zf(+) (Kontrollreaktion) aufgenommen haben, unterschieden werden. Die erfolgreiche Übertragung des lacZ-Gens wird durch die Bildung des funktionsfähigen Genproduktes nachgewiesen. Das Enzym ß-Galaktosidase, durch das lacZ-Gen codiert, spaltet das im Nähragar enthaltene synthetische Substrat X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-ß-D-galactosid), und es entsteht unter Sauerstoffeinfluss ein wasserunlöslicher Indigofarbstoff, der in den Bakterien ausfällt und die Kolonien blau färbt (vgl. Abbildung 5). IPTG (Isopropyl-ß-D-thiogalactosid), das ebenfalls auf den Nährboden aufgebracht wird, dient dabei als Induktor für die Expression des Gens.

Das Experiment kann im Schulunterricht auch zur Demonstration und Erläuterung des Operonmodells von Jacob und Monod eingesetzt werden.

Die phänotypische Veränderung der E. coli-Bakterien (blaue Färbung) belegt das erfolgreiche Einschleusen des nicht unterbrochenen lacZ-Gens.

In ähnlicher Weise wie in unserem Experiment das lacZ-Gen zur Bildung der ß-Galaktosidase bzw. das Luciferasegen in Bakterien eingeschleust wurde, werden heute mit Hilfe gentechnischer Methoden viele therapeutisch wirksame Proteine wie Insulin, Gerinnungsfaktor VIII oder Erythropoietin, aber auch viele in der Diagnostik eingesetzte oder in Waschmitteln enthaltene Enzyme in Bakterien hergestellt. Auch in diesen Fällen wird das entsprechende Gen mit Hilfe eines Vektors in Zellen eingeschleust, die dann als wirtschaftliche und umweltfreundliche Produzenten des gewünschten Proteins eingesetzt werden.

Die Klonierung ist jedoch nicht nur für die Produktion von Proteinen in der Industrie, sondern auch vor allem in der Grundlagenforschung eine wichtige Technik. Mit ihr gelingt es u.a. auch, genügend DNA herzustellen, um diese zu analysieren. Eine Voraussetzung, z.B. bei der Erforschung molekularer Ursachen von Krankheiten.

Die auf dieser Seite zu "Blue Genes" enthaltenen Informationen dienen dem Verständnis der beschriebenen Experimente. Wir empfehlen, zur Vertiefung weiterführende Lehrbücher der Molekulargenetik zu verwenden. An dieser Stelle sei auf die Folienserie "Biotechnologie/Gentechnik" des Fonds der Chemischen Industrie verwiesen, in denen die Molekulargenetik und die Gentechnik kurz und prägnant für den Unterricht dargestellt sind.

Weitere Literatur
T. A. Brown, Gentechnologie für Einsteiger, Spektrum Akademischer Verlag, 2002
H. W. Dellweg, Biotechnologie verständlich, Springer Verlag, 1994
W. Hennig, Genetik, Springer Verlag, 3. Auflage, 2002
R. Knippers, Molekulare Genetik, Thieme Verlag, 8. Auflage, 2001
B. Lewin, Molekularbiologie der Gene, Spektrum Akademischer Verlag, 2002
C. Mühlhardt, Der Experimentator: Molekularbiologie, Spektrum Akademischer Verlag, 3. Auflage, 2002