PCR-Inhibitoren sind Substanzen in der Probe, die die Aktivität der DNA-Polymerase beeinträchtigen können. Dazu gehören unter anderem Rückstände aus der Probenaufbereitung (z. B. Ethanol), Antikoagulanzien wie EDTA oder Heparin, z. B. aus Blutentnahmeröhrchen sowie Huminsäuren aus Umweltproben. Bereits geringe Mengen können den Cq-Wert verschieben und dadurch die Interpretation der Ergebnisse erschweren – etwa durch scheinbar veränderte Ausgangsmengen oder reduzierte Effizienz der PCR.

Ein mögliches Zeichen einer Hemmung sind unerwartet verschobene Cq-Werte ohne plausible biologische Erklärung. Dies kann besonders bei komplexen Probenmatrizes auftreten – wie Blut, Umwelt-, Pflanze oder Lebensmittelproben. In solchen Fällen sollte eine mögliche Hemmung als Fehlerquelle in Betracht gezogen werden.

PCR-Hemmung tritt am häufigsten bei Proben komplexer Zusammensetzung auf. Dazu gehören Umweltproben (z. B. Boden oder Wasser), klinische Proben (z. B. Vollblut oder Serum), Lebensmittelproben und Pflanzenmaterial. Diese Matrizes können verschiedene hemmende Substanzen enthalten, die die PCR beeinträchtigen.

Bei Proben, die potenziell hemmende Substanzen enthalten, ist es wichtig, die qPCR-Bedingungen entsprechend anzupassen. Dazu zählen z. B. eine optimierte Probenaufbereitung (z. B. mit ReliaPrep CleanUp oder ProNex) zur Reduktion von Inhibitoren oder der Einsatz von Master Mixen, die eine höhere Toleranz gegenüber Inhibitoren aufweisen. Falls die Zielkonzentration ausreichend hoch ist, bietet es sich an, eine Probenverdünnung durchzuführen um auf Inhibitoren zu testen. Ziel ist es, auch bei komplexen Matrizes zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen.

In der semi-logarithmischen (log) Ansicht ist die Schwelle korrekt gesetzt, wenn sie die Amplifikationskurven in deren linearem, aufsteigendem Bereich schneidet. Dieser Bereich erscheint in der log-Ansicht als gerade, parallele Linie.

Konkret bedeutet das:

1. Die Schwelle muss deutlich über dem Basisrauschen liegen.
2. Sie muss die Kurven im mittleren, linearen Bereich der logarithmischen Ansicht schneiden (= exponentielle Phase der Reaktion).
3. Sie sollte deutlich unter dem Plateau gesetzt sein, wo die Reaktion durch Reagensverbrauch begrenzt wird.

Eine gut gesetzte Schwelle erkennt man daran, dass alle Amplifikationskurven am Schnittpunkt ungefähr parallel verlaufen. Wenn die Schwelle im gekrümmten Übergangsbereich zum Plateau gesetzt wird, sind die Cq-Werte unzuverlässig.

Ja, unerwartet frühe (ungewöhnlich niedrige) Cq-Werte können auftreten und sind ein Zeichen eines Problems. Die häufigsten Ursachen sind:

• Zu viel Template: Wenn die Fluoreszenz bereits in frühen Zyklen die Schwelle erreicht, funktioniert die automatische Baseline-Definition nicht korrekt und führt zu falschen Messwerten.
• Kontamination: Kontamination der Reagenzien mit der Zielsequenz kann zu sehr frühen Cq-Werten führen.

Cq-Werte unter 15 sollten generell vermieden werden.

Grundsätzlich können nur Sonden-basierte Master Mixes für multiplex qPCR eingesetzt werden. Beim Multiplexing konkurrieren mehrere Primerpaare und Sonden um dieselben Ressourcen, was besondere Anforderungen an die Reagenzien stellt. Die wesentlichen Unterschiede liegen in der Polymerasekonzentration und -aktivität, der Pufferoptimierung für mehrere Primer-/Sondensysteme und der Inhibitorresistenz.

Folgende Optimierungsschritte haben sich in der Praxis bewährt:

• Validieren Sie zunächst jeden Assay als Singleplex und stellen Sie eine Effizienz zwischen 90 und 110 % sicher.
• Nutzen Sie FAM für schwach exprimierte Ziele (stärkstes Signal), schwächere Farbstoffe für abundante Ziele.
• Passen Sie das Primer-zu-Sonden-Verhältnis an: 1:1 für stark exprimierte Ziele, erhöhen Sie das Primer-Verhältnis für schwach exprimierte Ziele.
• Nutzen Sie einen Master Mix, der speziell für Multiplex-Anwendungen formuliert ist.

In vielen Fällen können Multiplex-Assays auch erfolgreich mit nicht speziell für diesen Zweck optimierten Reagenzien etabliert werden.

Primer-Dimere entstehen, wenn Primer aneinander statt an die Zielsequenz binden und anschließend von der Polymerase verlängert werden. Im Agarosegel erscheinen sie meist als kleine Banden unterhalb von 100 bp.

Begünstigt werden Primer-Dimere durch komplementäre Primersequenzen, hohe Primerkonzentrationen oder niedrige Annealing-Temperaturen.

Zur Reduzierung von Primer-Dimeren können folgende Maßnahmen helfen:

• Annealing-Temperatur erhöhen
• Primerkonzentration reduzieren
• Primerdesign überprüfen
• Eine Hot-Start-Polymerase verwenden – diese verhindert die Polymeraseaktivität während des Reaktionsaufbaus und kann die Bildung von Primer-Dimeren deutlich reduzieren.

Magnesiumionen sind für die Aktivität der DNA-Polymerase erforderlich. Die optimale Mg²⁺-Konzentration beeinflusst sowohl die Ausbeute als auch die Spezifität der PCR. Zu wenig Magnesium kann die Amplifikation reduzieren, während zu viel Magnesium unspezifische Produkte begünstigen kann.

Mit der GoTaq® G2 Flexi Polymerase kann der Magnesiumgehalt je nach Bedarf ganz flexibel angepasst werden, da MgCl₂ (25 mM) im separaten Tube enthalten ist.

Wenn kein PCR-Produkt nachweisbar ist, können verschiedene Faktoren die Amplifikation verhindert haben. Häufige Ursachen sind eine zu geringe Template-Menge, degradierte DNA, ungeeignete Primer oder eine zu hohe Annealing-Temperatur.

Folgende Optimierungsschritte können helfen:

• Template-Konzentration und -Qualität überprüfen
• Annealing-Temperatur mit einem Temperaturgradienten optimieren
• Primerdesign überprüfen
• Die Zykluszahl erhöhen
• Eine Positivkontrolle einsetzen, um die Funktion der PCR-Reagenzien zu bestätigen